DIFUSIÓN
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OBJETIVOS
LINEA I Nanosondas inteligentes:
Objetivo 1: Sondas infrarrojas on-off
Se planea desarrollar sondas luminiscentes capaces de emitir luz en el NIRII (~1100 nm) y con capacidad de interaccionar de forma específica con molécula de interés biológico, tales como Granzima B o γIFN. Estas sondas tienen la capacidad de sufrir cambios conformacionales cuando interaccionan con los biomarcadores lo que puede producir cambios medibles en la emisión fluorescente. De esta forma, las sondas desarrolladas servirían para identificar tejidos u órganos en los que existe un incremento en la concentración de dichos biomarcadores. El interés en estos biomarcadores radica en el hecho de que son secretados por los linfocitos y por lo tanto pueden ser empleados para cuantificar la actividad del sistema inmunitario. Esto puede ser de vital importancia en la monitorización de la inmunoterapia en tratamientos de cáncer y más específicamente en aquellos dirigidos al bloqueo de PDL1. Para ello, en este punto planteamos el desarrollo de diferentes sondas capaces de reconocer sendos biomarcadores y generar como respuesta a esta interacción cambios estructurales que puedan ser revelados mediante procesos de transferencia de energía entre un quencher y un fluoróforo (FRET). De forma más específica, desarrollaremos diferentes péptidos que sean sustrato de reacción de la Granzima B, de tal formar que una vez el enzima hidrolice el péptido, quencher y fluoróforo se separen, recuperando la emisión fluorescente. De forma análoga, se pretende utilizar aptámeros capaces de reconocer γIFN, generando tras esto un cambio conformacional que sirva de “gatillo” de la recuperación de la emisión por FRET. Las actividades asociadas a este objetivo son las siguientes:
Diseño de péptidos y aptámeros los cuales pueden ser modificados en sus dos extremos con un fluoróforo y un quencher.
Tanto péptidos como aptámeros serán producidos mediante síntesis en fase sólida. Tras la síntesis se evaluará su capacidad de interacción con los biomarcadores, bien analizando la capacidad catalítica de la Granzima en presencia de los péptidos o evaluando las constantes de afinidad entre aptámero y γIFN mediante experimentos DOSYNMR. Además, tras la síntesis las sondas serán caracterizadas química y estructuralmente mediante espectroscopia de masas, RMN, HPLC etc…
Síntesis de fluoróforos basados en moleculas orgánicas derivados del IT806, CH 1055 y dotc de Ag2S:
Así como de quenchers orgánicos y nanopartículas de CuS. En este punto la idea es sintetizar y modificar estos elementos para hacer viable su acoplamiento a los péptidos y aptámeros previamente descritos. Tanto fluoróforos como quenchers serán acoplados a posteriori a los péptidos y aptámeros en sus extremos terminal e inicial covalentemente. Esta parte se completará con un estudio espectroscópico.
Validación en laboratorio:
Antes de pasar a la validación in vivo, se realizarán ensayos de sensibilidad, selectividad, así como determinación de las concentraciones mínimas de biomarcadores necesarias para inducir cambios conformacionales medibles (límite de detección de la técnica). Para ellos se someterán las sondas a la presencia de los biomarcadores en concentraciones similares a las presentes en los sistemas biológicos en medios que mimeticen el ambiente tumoral. Esto permitirá evaluar las propiedades analíticas y optimizarlas.
Validación in vivo:
Proponemos un modelo basado en una cohorte de animales modelos desarrollados por el CNIO entre los que hay animales control, y animales con tumores de mama 4T1 injertados. Dentro de este grupo habrá animales no sometidos y otros sometidos a inmunoterapia de bloqueo PD1/L1. En los que se monitorizará no solo el crecimiento de los tumores sino además la producción de Granzima B y γIFN antes y después de la aplicación del tratamiento. Con esto se pretende obtener información acerca de los niveles de sendos biomarcadores, así como los tiempos en los que su concentración es máxima. Este tipo de información será empleada para optimizar no sólo la dosis y pautas administración de las sondas, sino que además permitirá correlacionar la señal pluorescente con los valores Granzima B y γIFN en los tejidos. En este punto se pondrá a punto la metodología de imagen NIR que permita obtener la mejor resolución para la visualización de las sondas en los modelos optimizando intensidad máxima de iluminación, tiempos de adquisición, y que permita relacionar señal fluorescente con concentración de biomarcadores, etc.
LINEA I Nanosondas inteligentes:
Objetivo 2: Nanopartículas magnéticas (MNPs) y ácidos nucleicos
Nos centraremos en MNPs modificadas con aptámeros relevantes para el diagnóstico de enfermedades oncológicas y cardiovasculares. En oncología se explorará el uso de AS1411, especifico de nucleolina, y S2.2, específicos de MUC1. Mientras que Gint4.T será empleado para detectar los procesos inflamatorios subyacentes a las patologías cardiovasculares. Los aptámeros serán modificados de forma que al cambiar su conformación durante el reconocimiento expongan al entorno una molécula que facilite la organización de las nanopartículas y de lugar a un cambio de señal. Las MNPs se diseñarán con capacidad de actuar como agentes de contraste en MRI y nanofocos de calor bajo campos magnéticos alternos para hipertermia magnética. Estas nanopartículas se combinarán con otros materiales para dar nanoestructuras híbridas con respuesta a estímulos externos (magnéticos y ópticos) y a estímulos internos o fisiológicos (condiciones redox y de pH en entorno celular). Las actividades concretas de este objetivo serán las siguientes:
Preparación de oligonucleótidos modificados para la funcionalización de nanopartículas.
Se prepararán secuencias relacionadas con los aptámeros de interés con modificaciones químicas que aumenten su estabilidad en plasma, faciliten su conjugación a nanopartículas y la modulación de la agregación de las nanoestructuras
Preparación de nanopartículas magnéticas:
Estarán basadas en ferritas (MxFe3xO4) y se prepararán por métodos químicos (coprecipitación, descomposición térmica)
Preparación de nanoestructuras híbridas inorgánicas:
Las nanopartículas híbridas de tipo ferrita se usarán como semillas para la descomposición y crecimiento en su superficie de precursores de metales con resonancia de plasmón superficial (p. ej. Au, Ag, Cu) y otros materiales funcionales (óxido de manganeso), etc.
Funcionalización de nanopartículas con los ácidos nucleicos:
Los oligonucleótidos preparados en la actividad 2.1 se utilizarán en la funcionalización de nanopartículas preparadas en las actividades 2.2 y 2.3. Las nanopartículas también se modificarán con moléculas fluorescentes (e.g., Cy5, Cy7) para facilitar su localización mediante fluorescencia, así como sondas para la detección de especies reactivas de oxígeno (e.g., DCFDA), las cuales están aumentadas tanto en la enfermedad cardiaca como en tumores. En algunos casos será necesaria la modificación de nanopartículas para facilitar su funcionalización. Las nanopartículas se incubarán con los oligonucleótidos a temperatura ambiente durante 16h, y posteriormente se centrifugarán a baja velocidad y se decantará el sobrenadante. Este proceso se repetirá 2 veces. Las nanopartículas modificadas obtenidas se caracterizarán mediante DLS, TGA, XRD, TEM, VSM, relaxometría y UVvis. La capacidad de generar calor mediante la aplicación de campos magnéticos alternos se llevará a cabo con los aplicadores de campo (caseros y comerciales) de IMDEANano, mientras que capacidad de generar calor bajo irradiación láser en el NIR se estudiará por el nanoBIG.
Evaluación en cultivos celulares:
Los sistemas serán evaluados en diversas células de cáncer de mama (e.g., MCF7, MB231, MCF10 A) y pulmón (H2030 BrM3, A549). En estos estudios se evaluará la toxicidad mediante el sistema de Alamar Blue, así como la interacción con las células e internalización mediante técnicas de cuantificación (e.g, ICPmass, ferrocina) y microscopia (e.g. TEM)
Evaluación en modelos animales:
Las nanopartículas se evaluarán en distintos modelos animales de tumores. En el caso del cáncer de pulmón se utilizarán modelos xenograft subcutáneos obtenidos a partir de la línea H2030 BrM3 en hembras atimicas nude homocigotas para Foxn1, a las que se inyectarán 1.5x106 células al 50% en matrigel. También se utilizará un modelo metastático obtenido mediante la inyección de las células el ventrículo izquierdo en ratonas atímicas nude de aproximadamente 67 semanas. En caso del modelo de cáncer de mama, para el modelo xenograft subcutáneo y el metastatico se inyectarán 3x106 células MB231 como en el caso anterior Adicionalmente, se generará un modelo ortotópico mediante la inyección de las células en la glándula mamaria. Las células H2030 BrM3 como las MB231 han sido modificadas con GFP, lo que facilitará su localización por fluorescencia, así como las MNPs marcadas con fluoroforos. Posteriormente, también se evaluará su detección por RMN. Por otra parte, usaremos modelos de ratón de daño agudo de pulmón (ALI) por instilación intratraqueal de LPS (para detección de targets inflamatorios y endoteliales); así como el modelo de infarto agudo de miocardio (IAM) por ligadura de la arteria coronaria descendiente en ratón con una isquemia de 40min y posterior reperfusión (para detección de targets inflamatorios y de funcionamiento mitocondrial), y el modelo de cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina. La detección se realizará mediante técnicas de fluorescencia, y una vez optimizado los sistemas se evaluarán por RMN.
LINEA II: Inmunoimagen
Objetivo 3: Marcaje de anticuerpos, "nonabodies" y fragmentos para la imagen.
Esta actividad consiste en la funcionalización a la carta de biomoléculas que se utilizan como vectores tales como nanobodies (anticuerpos miniaturizados contra PDL2), péptidos dirigidos contra integrinas, fibrina (estudios Alzheimer), exosomas y fármacos (i.e: doxorrubicina y metoprolol entre otros) con grupos químicos poco voluminosos capaces de producir reacciones bioortogonales (click chemistry in vivo). Esta metodología permite el acoplamiento de los vectores con sondas moleculares nucleares PET (radioisótopos) y fluorescentes (en el NIR), permitiendo su uso como agentes de imagen, incrementando la flexibilidad del marcaje y en último término aumentando su acumulación in vivo en el tejido o proceso diana de estudio. Para ello, plantemos la preparación de una librería de compuestos basados en parejas click tales como; DBCOsidnonas, DBCOclorosidnonas, sidnonasTMTH o terazinaTCO que se caracterizan por exhibir elevadas constantes cinéticas de reacción, posibilitando el marcaje de moléculas tras su administración (pretargeting). Dentro de estas parejas “click” incluiremos sondas moleculares basadas en fluoróforos con emisión en el NIR (IR806, CH1055, etc.) así como agentes quelantes (DOTA, NOTA, DTPA marcados radiactivamente con isótopos para diagnósticos y terapéuticos como Lutecio 177 (177Lu), Circonio 89 (89Zr) o Galio 68 (68Ga). Tras una primera etapa química de síntesis de derivados click, se llevará a cabo la evaluación de la efectividad de esta aproximación tanto en estudios in vivo como in vitro para determinar el aumento de la acumulación de estos agentes de imagen y la eficiencia del diagnóstico. Las actividades específicas de este objetivo son las siguientes.
Síntesis de de parejas click y funcionalización de vectores:
Inicialmente se preparará una librería de parejas “click” utilizando los métodos sintéticos previamente desarrollados por el consorcio como DBCOsidnonas, DBCOclorosidnonas, sidnonaTMTH y tetrazinaTCO las cuales pueden ser acopladas a los vectores propuestos y sondas que serán producidas mediante reacciones ya establecidas en nuestro laboratorio. Éstas serán modificadas desde síntesis con grupos NHS, isotiocinatos y/o maleimidas, que permiten su acoplamiento a nanobodies, exosomas, fármacos y/o péptidos, dando lugar a vectores modificados con las subunidades click. Por otro lado, se producirán fluoróforos NIR con estructuras similares al CH1055, IR806 con funcionalizaciones click complementarias a las existentes en los vectores. Además, dentro de esta actividad se realizará la modificación de grupos quelantes de uso en PET tales como NOTA, DOTA, DTPA utilizando reacciones de acoplamiento selectivos a grupos funcionales existentes. Esta parte irá acompañada de una extensa caracterización molecular que incluye espectroscopia de masas, FTIR, RMN, HPLC, etc
Marcaje radiactivo:
Los derivados producidos en la actividad 4.1 modificados con quelantes serán marcados con isótopos radiactivos metálicos tales como 89Zr o 68Ga. En el caso del marcaje con el isótopo 89Zr, dicho marcaje se llevará a cabo en condiciones suaves optimizadas por nuestro laboratorio.
Validación in vitro:
se llevará a cabo mediante estudios de captación empleando células de interés para el vector empleado, por ejemplo líneas H2030 BrM3 establecida desde un ganglio linfático metastásico de un adenocarcinoma de pulmón con la mutación KRASG12C para aquellos estudios con aplicación en oncológicos y cardiomiocitos en el caso de los estudios dirigidos a aplicaciones cardiológicas como los de cardiotoxicidad producidos por doxorubicina. Para los fármacos metoprolol y Atenolol, un modelo de migración celular por transwell que evalúa efecto que las modificaciones producidas en las moléculas ejercen en la acción farmacológica.
Validación in vivo:
En general se van a desarrollar dos grupos de modelos, unos para aplicación oncológica en un modelo de glioblastoma, previamente descrito. Para estudios cardiológicos e inflamatorios usaremos modelos de daño agudo de pulmón e infarto de miocardio (útil para estudios fármacos click metoprolol y atenolol) y el modelo de cardiotoxicidad (útil para el estudio de doxorubicina click). Otros modelos que serán utilizados corresponden a ratones TgCNRD8 que desarrollan acúmulos de proteínas Aβ y son útiles para estudios en Alzheimer
LÍNEA III: Termoterapia
Objetivo 4: Termometría avanzada para fototerapia
El desarrollo de la fototerapia (tratamiento basado en el calentamiento local creado por radiaciones láser) se ve actualmente frenado por la ausencia de técnicas que permitan dotarla de control térmico en tiempo real (asegurando así que se está trabajando en el rango terapéutico). La nanotermometría (uso de nanopartículas para determinar la temperatura de células, tejidos y órganos) podría ser la solución, aunque, a día de hoy, tiene tres grandes limitaciones: baja resolución, baja fiabilidad e incapacidad para proveer información tridimensional. Este objetivo pretende desarrollar nuevos nanomateriales y tecnologías que superen estas limitaciones de forma simultánea. Por una parte, se propone la combinación de la tomografía óptica (OCT) con nanopartículas poliméricas con transiciones de fase estructurales en el rango fisiológico (3347 ºC) para la obtención de imágenes térmicas tridimensionales. Por otro lado, se desarrollará una nueva generación de nanopartículas luminiscentes infrarrojas capaces de calentar localmente y de proveer una lectura térmica fiable y precisa.
Diseño y síntesis de nanopartículas plasmónicas:
Diseño y síntesis de nanopartículas plasmónicas decoradas con polímeros termosensibles para ser utilizadas como elementos nanocalentadores capaces de proporcionar imágenes térmicas en OCT. El núcleo plasmónico (nanoestrellas o nanobastones de oro) será el encargado de calentar mientras que la transición de fase del recubrimiento polimérico dotará a las nanopartículas sensibilidad térmica en OCT.
Diseño y síntesis de nanopartículasbasadas en sulfuro de plata:
Diseño y síntesis de nanoestructuras basadas en nanopartículas de sulfuro de plata y nanopartículas dieléctricas dopadas con iones lantánidos que muestren altas eficiencias conversión luzcalor (> 90%) y altas sensibilidades térmicas (> 2%/ºC) basadas en su vida media de fluorescencia.
Funcionalización de las nanoestructuras:
Para lograr su acumulación preferencial en trombos, placas de ateroma, glioblastoma y modelos de metástasis óseas y cerebrales de cáncer de mama y pulmón.
Validación in vitro:
El potencial de las nanopartículas sintetizadas en las actividades 7.1 y 7.2 será probada primero en procesos de fototermia en cultivos celulares (HeLa, GL2621, HMEC, RAW264.7) mediante el uso de la microscopia de campo oscuro y la microscopia de fluorescencia infrarroja
Termoterapia in vivo de trombosis.
Se plantea el uso de las nanopartículas sintetizadas para la disolución térmica controlada de trombos en un modelo de trombosis venosa mediante el tratamiento con FeCl3 de la arteria femoral del ratón. Esta actividad requerirá la funcionalización de las nanoestructuras (con scFv o cRGD) para dotarlas de afinidad a trombos sanguíneos, más específicamente a las plaquetas activadas en la trombosis aguda.
Termoterapia in vivo de glioblastoma.
Se plantea el uso de las nanoestructuras desarrolladas para el desarrollo de procesos de fototerapia controlada in vivo en un modelo murió de glioblastoma ortotópico (GL261). Para ello las nanoestructuras serán funcionalizadas para lograr su acumulación preferencial en el tumor intracraneal. Se plantea su funcionalización con el péptido cRGD y con el anticuerpo antiEGFR. Se explorarán diferentes vías de administración (inyección directa, administración nasal y administración intravenosa).
Fototerapia controlada in vivo de aterosclerosis.
Se plantea el uso de las nanopartículas desarrolladas en la actividad 7.2 para la ablación selectiva de placas inestables, ricas en macrófagos y neutrófilos, en el modelo ApoE/ sometidos a dietas ricas en grasa. La acumulación selectiva en las placas de ateroma requerirá la funcionalización de las nanopartículas con dextran, y anticuerpos (i.e. anti MPO, anti VCAM1), otras funcionalizaciones planeadas para el marcaje sería el uso de anticuerpos anti LDL oxidada y alendronatos capaces estos últimos de marcar las microcalcificaciones presentes en estas placas. Todos estos marcajes permitirían diagnosticar y atacar placas en riesgo de desprendimiento.
Fototerapia controlada de metástasis óseas y cerebrales de cáncer de mama y pulmón.
Se plantea el uso de las nanopartículas sintetizadas en la actividad 7.2 para la detección y tratamiento térmico de metástasis. La acumulación selectiva en las metástasis requerirá de la funcionalización de las nanopartículas con MTT1.
LÍNEA III: Termoterapia
Objetivo 5: Hipertemia magnética
Se prepararán materiales implantables consistentes en pequeñas piezas de polímero dopados en la superficie con nanopartículas magnéticas. El objetivo es investigar el efecto del calor generado bajo campos magnéticos alternos (hipertermia magnética) en la eliminación o inhibición de la formación de biofilm bacteriano. Las actividades concretas que realizar son:
Preparación de nanopartículas magnéticas:
Estarán basadas en ferritas (MxFe3xO4) y se prepararán por métodos químicos (coprecipitación, descomposición térmica). Se prepararán nanopartículas de diferentes tamaños medios, en un intervalo adecuado para generar calor (de 14 a 25 nm), con el objeto de seleccionar las más adecuadas para la aplicación. Se emplearán recubrimientos que proporciones diferentes características de carga y grupos funcionales para elegir los que más favorezcan la adhesión posterior al material polimérico. Se contemplará, además, la preparación de nanopartículas híbridas formadas por una parte de ferrita y otra de composiciones que puedan tener un efecto antibacteriano per se (por ej. Cu y derivados).
Preparación de polímeros dopados con nanopartículas magnéticas:
El material sobre el que se depositarán las nanopartículas serán trozos de catéteres de 0.51 cm aprox. Las nanopartículas preparadas en la actividad 8.1 se depositarán en la superficie de las piezas de catéter bien mediante preactivación de la superficie, evaporación de coloide a temperaturas moderadas y ayuda de un imán. Se estudiarán diferentes cargas o concentraciones de nanopartículas. Dependiendo de los resultados, se contemplará el uso de otros materiales implantables (otros polímeros como poliuretanos o teflón, materiales inorgánicos y cerámicos).
Caracterización fisicoquímica:
Las partículas obtenidas serán caracterizadas por las técnicas habituales como XRD, TEM, DLS, VSM, y medidas de tiempos de relajación. La adhesión de las nanopartículas al catéter se estudiará mediante SEM y la cuantificación de las nanopartículas adheridas se hará fundamentalmente mediante análisis elemental ICPOES previa digestión de la muestra. La capacidad de generar calor mediante la aplicación de campos magnéticos alternos se llevará a cabo con los aplicadores de campo (caseros y comerciales) de IMDEANano
Actividad antibacteriana in vitro:
Se investigará si las nanopartículas, preparadas en la actividad 8.1, tienen alguna actividad antibacteriana en cultivos bacterianos, S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans (todas ellas cepas bioluminiscentes) cuando se aplica un campo magnético alterno directamente sobre el cultivo tratado con las nanopartículas.).
Validación in vivo:
Se seleccionará el microorganismo que mejor resultados ofrezca en la act. 5.4 para infectar porciones de 0.51 cm abocats de 1822G que serán implantados subcutáneamente en ratones inmunocompetentes. Se comparará el crecimiento y proliferación de la infección mediante bioluminiscencia en implantes tratados y sin tratar con las nanopartículas, todos sometidos a campo magnéticos. Para la aplicación de campo magnético alterno, se empleará el sistema preclínico portable MACH1 (Resonant Circuits Ltd.). Los estudios de imagen se realizarán cada 2 días a los 10 días se sacrificarán los animales y se realizarán cultivos microbiológicos para cuantificar el número de colonias
LÍNEA IV: Teragnóstico.
Objetivo 6: Técnicas y aplicaciones en radioterapia molecular con Lutecio 177.
El objetivo del trabajo es el cargo de biomoléculas tales como anticuerpos, péptidos y nanopartículas) con el isótopo teragnóstico Lutecio 177, (177Lu) para su uso como radioterapia dirigida. Este radionúclido β con vida media de 6,7 días es ideal para la teragnosis (terapia+diagnostico), ya que además de ser emisor de partículas β y/o electrones Auger, adecuada para terapia efectiva, emite fotones γ acompañantes pueden ser empleados también para el diagnóstico mediante imagen nuclear (SPECT). El objetivo se compone de las siguientes actividades::
Marcaje radiactivo y caracterización:
Para el marcaje radiactivo de las biomoléculas (anticuerpos selectivos de marcadores tumorales, péptidos protumorales y nanopartículas) éstas serán inicialmente funcionalizadas con quelantes selectivos de este radiometal tales como DOTA o DTPA. Tras la conjugación y purificación del conjugado quelantebiomolécula se llevará a cabo el marcaje radiactivo con el isótopo comercial 177LuCl3 empleando condiciones suaves (medio neutro con PBS, 37ºC, 60 min) para no modificar la estructura de la biomolécula. Finalmente se llevará a cabo la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas radiactivas mediante técnicas cromatográficas radiactivas.
Estudios in vitro:
Se evaluará mediante estudios in vitro a diversos tiempos y dosis el efecto terapéutico de las nanopartículas en líneas tumorales tales como células tumorales de melanoma (B16F10), mama (4T1 y MDA MB231) y de cerebro (U87), así como en células control como fibroblastos o macrófagos. La evaluación cualitativa se llevará a cabo mediante microscopía de campo claro y la cuantitativa mediante contador gamma y citometría de flujo
Estudios farmacocinético:
Una vez validada la efectividad in vitro de nuestras radioterapias se llevará a cabo el estudio farmacocinético in vivo de las radiomoléculas a través de estudios del i) tiempo de circulación en sangre, ii) cuantificación de la unión a proteínas de plasma mediante HPLC sobre muestras de suero, iii) estudios in vivo de biodistribucion mediante imagen PETCT y cuantificación de los órganos o regiones de interés, iv) estudios ex vivos de biodistribución en órganos y iv) autorradiografia histológica e inmunohistoquímica de los tejidos para determinar las regiones específicas en tumor en las que se acumula la radioterapia
Validación in vivo:
Finalmente se llevará a cabo la validación terapéutica in vivo de la radioterapia dirigida en modelos tanto de mama (MDA MB231) como de glioblastoma (U87) con capacidad metastásica que incluyen el reportero de Luciferasa y expresan GFP para la realización del seguimiento del crecimiento tumoral mediante biolumiscencia y fluorescencia. En ambos casos se realizarán xenograft subcutáneo en flanco dorsal. Para ello inyectaran 3x10 6 células en una mezcla 1:1 de matrigel a ratonas nude hembras de 5 semanas de edad. Una vez que el tumor adquiera un tamaño idea (inferior a 0.5 cm) se llevará a cabo la administración del tratamiento y el seguimiento longitudinal tumoral tanto por imagen SPECT como mediante la medida de diversos parámetros como tamaño tumoral como del peso de animales.
LÍNEA III: Teragnóstico.
Objetivo 7: "Trearment delivery": métodos basados en nanopartículas orgnánicas (liposomas, y exosomas) o en nanopartículas inorgánicas (metales y óxidos metálicos)
En este objetivo se aborda la preparación de distintas nanopartículas con agentes terapéuticos. Sobre estas nanoestructuras también se incorporarán grupos direccionantes basados en moléculas pequeñas, aminoácidos o ácidos nucleicos. De esta manera las nanopartículas ejercerán su acción principalmente en las zonas de interés, reduciéndose los efectos secundarios
Nanopartículas orgánicas:
Se llevará a cabo la síntesis de nanopartículas orgánicas radiactivas para su aplicación como sistemas de liberación de tratamientos controlados. Se emplearán tanto exosomas procedentes de fuentes naturales (leche), como liposomas artificiales sintetizados en el laboratorio. Debido a la presencia de una superficie hidrofóbica compuesta por una bicapa lipídica y un núcleo acuoso, este tipo de nanopartículas permitirán la incorporación de terapias solubles en agua en su lumen o de fármacos hidrofóbicos en su membrana. Las metodologías químicas empleadas se centrarán, por una parte: i. Coordinación o funcionalización covalente de ligandos/biomoléculas/fármacos con una probada eficacia biológica en su estructura (fármacos tales como doxorrubicina, ácido fólico, anticuerpos selectivos de receptores Membrana, péptidos selectivos de integrinas tipo RGD) ii. Incorporación pasiva en el interior de la nanopartícula empleando incubaciones tradicionales (37ºC y agitación) y detergentes (saponinas)..
Nanopartículas inorgánicas:
Se prepararán nanopartículas magnéticas utilizando los ligandos desarrollados en la actividad 2 para favorecer la localización de los tejidos/células a detectar. Estos sistemas podrán usarse en la detección de las enfermedades mediante RMN, y por otra parte aplicar un tratamiento basado en hipertermia magnética. Complementariamente, se modificarán las nanopartículas con moléculas bioactivas (e.g., fármacos, ácidos nucleicos) para maximizar la terapia final. Por ejemplo, contra el cáncer de mama se usarán derivados de doxorrubicina y para el cáncer de pulmón un combinado de microRNAs supresores de tumores (e.g., mir34a, mir144, let7b). Se prepararán conectores sensibles a la temperatura con los que se conjugarán las moléculas bioactivas. Por tanto, la liberación de las moléculas terapéuticas se podrá controlar mediante la inducción de la hipertermia magnética. En el caso de las nanopartículas magnetoplasmónicas preparadas en la actividad 2, se estudiará la combinación de hipertermia magnética y fototermia en colaboración con el nanoBIG.
Estudios in vitro:
La efectividad de los nuevos nanoconjugados se evaluará in vitro mediante estudios de liberación en disolución mediante medidas de absorbancia o en cultivos celulares mediante estudios de confocal y citometría, así colorimétricos XTT y MTT tanto en células de interés (tumorales y cardiacas) como en control (epiteliales, fibroblastos, macrófagos)
Validación in vivo:
Se llevarán a cabo estudios longitudinales de dosis/efecto y posterior confirmación histológica para evaluar la efectividad del tratamiento. Se empleará un modelo tumoral y otro inflamatorio. En cuanto al modelo tumoral se realizará un xenograft subcutáneo en flanco dorsal, inyectando 3x106 células U87 o MDA MB231GFP) en una mezcla 1:1 de matrigel a ratones nude hembras de 5 semanas de edad. Una vez que el tumor adquiera un tamaño idea (inferior a 0.5 cm) se llevará a cabo la administración del tratamiento y el seguimiento longitudinal tumoral tanto por imagen (MRI u óptica) como mediante la medida de diversos parámetros como tamaño tumoral o del peso de animales. El modelo de inflamación se inducirá mediante la administración endotraqueal de LPS (lipopolisacárido de E. coli), pasadas 24 horas se realizarán los estudios de imagen cada 23 días con el objetivo de estudiar la dosis/efecto de los compuestos