DIFUSIÓN
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OBJETIVOS
Síntesis de nanoparticulas luminiscentes infrarrojas y validación para imagen de daño isquémico
Este objetivo tiene como fin último la localización de tejidos isquémicos en el sistema cardiovascular mediante la combinación de nanopartículas luminiscentes infrarrojas y técnicas avanzadas de imagen por fluorescencia.
Este objetivo abarca desde la síntesis de nuevas nanopartículas (NP) y funcionalización hasta su empleo en modelos animales (experimentación in vivo). Se plantea la realización de las siguientes actividades:
Síntesis de nanopartículas luminiscentes infrarrojas:
La actividad inicial consiste en la síntesis de NP luminiscentes infrarrojas que presenten líneas de emisión en la segunda (10001350nm) y tercera ventana biológica del espectro (15001800 nm) bajo excitación en la primera ventana (650950 nm). Estas condiciones permitirán la adquisición de imágenes de fluorescencia con alta penetración en tejidos, mediante el uso de fuentes de excitación láser de bajo coste. Para ello planeamos la síntesis de dos tipos de NPs, tales como nanocristales coloidales de matrices dieléctricas dopados con iones de tierras raras (Nd3+, Ho3+, Pr3+,Tm3+, Yb3+ y Er3+) las cuales presentan emisión eficiente en el infrarrojo como por ejemplo nanopartículas NaGdF4:Nd3+/NaGdF4, que pueden ser excitadas en la primera ventana biológica y emitir en la segunda y tercera ventana. Por otro lado, sintetizaremos nanocristales semiconductores (puntos cuánticos) basados en estructuras “core@shell” de PbS y CdS así como nanocristales de Ag2S con altas eficiencias cuánticas de emisión. Con el fin de poder emplear estas NP para el reconocimiento de tejidos cardiovasculares dañados esta actividad incluye también su funcionalización superficial de estas nanopartículas con la proteína anexina a5 y el péptido angiotensina (AT) II para el reconocimiento específico de los marcadores de daño cardiovascular fosfatidilserina (PS) y el receptor AT1, respectivamente.
Caracterización estructural y óptica de nanopartículas luminiscentes infrarrojas:
Posteriormente a su síntesis el equipo investigador procederá a caracterizar los nanomateriales obtenidos para identificar entre ellos aquellos que resulten prometedores como elementos de contraste para imagen por fluorescencia. Se incluye aquí la caracterización estructural y morforlógica de las nanopartículas mediante técnicas tales como microscopía electrónica (TEM, SEM, EDX, TAAF,etc.), dispersión óptica dinámica (DLS), y medida de propiedades electrostáticas (Z Scan). De forma simultánea se emplearán técnicas básicas de espectroscopia óptica (fotoluminiscencia bajo excitación con fuentes láser continuas y pulsadas) para determinar las propiedades luminiscentes de las estructuras. Al término de esta actividad el equipo investigador contará con una biblioteca de nanopartículas cuyas propiedad (tamaño, brillo, estabilidad coloidal, etc..) satisfagan los requisitos necesarios para su aplicación en sistemas biológicos.
Estudio de biocompatibilidad in vitro: Esta actividad contempla la realización de experimentos de toxicidad a nivel celular de aquellas NP catalogadas como óptimas en la Act.2.2.
Estos experimentos se realizarán sobre diferentes líneas celulares tales como: NCIH295R, cardiomiocitos humanos inmortalizados y/o células endoteliales vasculares de coronaria humana. Se analizará la toxicidad de los diferentes nanomateriales (funcionalizados o no), así como ensayos de cinética y dosisrespuesta. A nivel de la membrana plasmática éstas se evaluarán mediante exclusión de compuestos impenetrables como el azul de tripán. A nivel de mitocondria se realizarán ensayos de MTT y estudios de reconocimiento de marcadores de muerte celular tales como la Anexina.
Detección in vivo de daño isquémico:
En esta actividad se pretende utilizar aquellas NP con propiedades óptimas y baja toxicidad (identificadas en las actividades 2.2 y 2.3) para la detección de tejidos isquémicos en modelos animales (ratones) mediante imagen por fluorescencia infrarroja Para ello crearemos de forma controlada daño isquémico en corazón (mediante la realización, bajo anestesia, de isquemia coronaria por oclusión de la arteria coronaria descendente anterior), cerebro (mediante oclusión de la carótida) y en extremidades (mediante la oclusión de la femoral). La imagen de fluorescencia de los tejidos isquémicos se obtendrá, de forma no invasiva, a partir de las NP (funcionalizadas o no) inyectadas por vía intravenosa en el animal anestesiado usando el equipo de imagen desarrollado en el FIG y cuya automatización y optimización será realizado en colaboración con la empresa LASING.
Síntesis y validación de nanoestructuras para uso multimodal resonancia magnéticaóptica y validación en modelos cardiovasculares y oncológicos
Este objetivo tiene como fin último la obtención de imágenes multimodales para aplicaciones de diagnosis de afecciones del sistema cardiovascular detección de tejidos isquémicos e inflamación) así como para localización de tumores primarios y metástasis.
Síntesis de nanopartículas multimodales basadas en la combinación mediante encapsulamiento polimérico de nanopartículas magnéticas y luminiscentes:
Síntesis y funcionalización de nanopartículas capaces de generar contraste multimodal, en concreto nanopartículas dieléctricas basadas en matrices inorgánicas de Gd3+ que aporta a la nanopartícula propiedades magnéticas, dopadas con diferentes iones de tierras raras que generan luminiscencia infrarroja (tales como Yb3+, Tm3+, Er3+, Nd3+). Estas NP multimodales serán utilizadas para la obtención de imagen multimodal (Fluorescencia+RM) del sistema cardiovascular y de tumores primarios y secundarios (metástasis).
Síntesis de nanoestructuras híbridas optomagnéticas mediante encapsulamiento polimérico:
Se plantea la fabricación y funcionalización de nanoestructuras optomagnéticas mediante el encapsulamiento polimérico de NPs luminiscentes infrarrojas (NP dieléctricas dopadas con iones de tierra raras o puntos cuánticos) y NP magnéticas (NP de óxido de hierro). Estas nanoestructuras híbridas serán
utilizadas para la obtención de imagen multimodal (Fluorescencia+RM) del sistema cardiovascular y de tumores primarios y secundarios (metástasis).
Caracterización de las estructuras multimodales:
Se realizará una caracterización de las propiedades estructurales, composicionales magnéticas, ópticas, fluorescentes de las nanoestructuras desarrolladas en las actividades Act.3.1 y Act.3.2 mediante la combinación de las diferentes técnicas disponibles por el equipo investigador: TEM, SEM, EDX, TAAF, DLS, Z Scan, PLE, espectroscopia de absorción, HPLC, RM, EPR etc… Al término de esta actividad el equipo investigador contará con una biblioteca de nanopartículas cuyas propiedades satisfagan los requisitos necesarios para su aplicación en sistemas biológicos.
Estudio de biocompatibilidad in vitro
Esta actividad contempla la realización de experimentos de toxicidad a nivel celular de aquellas nanoestructuras catalogadas como óptimas en la Act.3.3. Para ello diversas concentraciones de las NP (desde mM a mM) serán incubadas en presencia de células control (fibroblastos), evaluando su efecto citotóxico a diversos tiempos de incubación (24h, 48h y 72h) mediante estudios de proliferación y colorimétricos MTT.
Obtención de imagen in vivo multimodal de modelos tumorales primarios y secundarios:
En esta actividad se pretende utilizar aquellas nanoestructuras con propiedades óptimas y baja toxicidad (identificadas en Act.3.3. y Act.3.4.) para la obtención de imagen multimodal de modelos tumorales de melanoma metastásico (TyrERT2:CreBRAFV600) para la detección de metástasis a distancia sobretodo
cerebrales (RM) y linfáticas (fluorescencia). Para la inducción de la formación de melanomas en modelos genéticos que contienen el alelo BRaf
V600E loxP. Se realizará el tratamiento tópico con 3ul de 4Hidroxitamoxifeno(4HT) 2mg/ml en etanol 3 días consecutivos. El seguimiento del tumor primario se realizará mediante la medida de la superficie cubierta por melanoma con un calibre cada 3 días. El diagnóstico multimodal de las metástasis se iniciará una vez que los tumores primarios alcancen un tamaño de 250 mm3.
Obtencion de imagen in vivo multimodal de daño cardiovascular:
En esta actividad se pretende utilizar aquellas nanoestructuras con propiedades óptimas y baja toxicidad (identificadas en Act.3.3. y Act.3.4.) para la obtención de imagen multimodal de tejido isquémico en el sistema cardiovascular tanto en el corazón (modelos de infarto de miocardio) como en el cerebro y extremidades (modelos de isquemia tras accidente cardiovascular). Para la inducción de isquemia coronaria, se utilizará la técnica de Langendorff para la perfusión de corazón aislado y se ocluirá transitoriamente la arteria coronaria descendente anterior izquierda. La isquemiareperfusión cerebral se llevará a cabo por medio de la técnica del filamento intraluminal en la arteria cerebral media de ratón y la isquemia de la extremidad posterior se realizará mediante la doble ligadura y resección de una arteria femoral. La duración de la oclusión dependerá del modelo utilizado y variará entre 30 minutos para el caso de la coronaria y permanente para el caso de la extremidad. En los experimentos in vivo, el seguimiento del bienestar de los animales será diario. El diagnóstico multimodal de la isquemia se iniciará, en todos los casos, desde el momento de la inducción de la misma.
Evaluación de estrategias para el marcaje de macrófagos y validación en modelos cardiovasculares y de infección
La respuesta inflamatoria es uno de los principales mecanismos de defensa ante infecciones causadas por diversos tipos de microorganismos, a través de la activación inicial de diversos procesos proinflamatorios, especialmente macrófagos durante el proceso inflamatorio, estos macrófagos activados sobreexpresan de manera específica receptores de folato. Debido a la elevada especificidad del ácido fólico hacia los receptores folato, (KD< 1nM) ha comenzado a emerger el diseño de nuevos trazadores basados en moléculas de ácido fólico marcadas como herramienta ideal para la detección de macrófagos mediante imagen molecular.
Síntesis de sondas radiactivas basadas en la molécula folato para marcaje directo de macrófagos:
Como primera etapa de nuestro trabajo desarrollaremos la síntesis de una librería de nueve trazadores 68GaNOTAfolato a partir de las moléculas NODAGA NODAGANHS y NH2NODAGA basadas en la estructura del ácido Triazaciclonona1,4,7triacético NOTA. Estos macrocíclos seleccionados por el gran poder quelante y afinidad del NOTA hacia el Ga, serán funcionalizados con moléculas folatoderivadas (ácido fólico, PAMAfolato o EC20) mediante la conjugación entre los grupos funcionales amino y carboxílico. El marcaje radiactivo de las nuevas moléculas se llevará a cabo en presencia de 68GaCl3 obtenido a partir del generador 67Ge68Ga (Eckert & Ziegler) disponible en las instalaciones del Instituto. Dicho radiomarcaje se realizará siguiendo los protocolos de Velikyan et al., (JNM, 2008) y su purificación con ayuda de HPLC. Para cada una de las moléculas que componen la nueva librería se analizarán propiedades farmacocinéticas tales como hidrofobicidad (LogP), capacidad de unión a proteínas de plasma, estabilidad en suero o estabilidad metabólica en plasma.
Marcaje indirecto de folato:
Como segunda actividad se prepararán nanopartículas híbridas multimodales (sistema radioóptico) basadas en NP con emisión NIR (infrarrojo cercano) funcionalizadas superficialmente con moléculas folato y agentes quelantes (DOTA o NOTA) que pueda ser posteriormente marcada radiactivamente con 68Ga. Para ello la actividad se divide en dos procesos:
Síntesis funcionalización de nanopartículas (NP) folato con quelante (Folatoquelante):
Para este fin, el grupo de la UCM sintetizará NP fluorescentes con elevada eficiencia cuántica y con emisión en la región NIR, tales como las basadas en tierras raras (dopadas con Er3+, Tm3+, Yb3+, Gd3+ o Nd3+) así como NP semiconductoras (Ag2S, CdSe, PbS). Estas NP serán tras su síntesis convenientemente funcionalizadas con cubiertas nanométricas de sílica o de polímero. En este punto pretendemos introducir grupos funcionales tales como residuos carboxílicos, lo cuales serán utilizados como puntos de anclaje de moléculas quelantes de radioisótopos tales como NH2DOTAGA NH2NODAGAy de moléculas derivadas del folato tales como folatoPEGNH2 aportando a las NP especificidad hacia macrófagos a la vez que la subunidad PEG confiere estabilidad coloidal al sistema en conjunto.
Marcaje de las NP folatoquelante:
Una vez sintetizas las nanopartículas y como punto final éstas serán marcadas en el BiiG con 68Ga3+ utilizando para ello 68GaCl3 generado en generador 68Ge/68Ga dando como resultado NP híbridas con propiedades radioópticas con el fin de no alterar el comportamiento natural tanto de la biomolécula (folato) como de las nanopartículas, para dicho marcaje radiactivo se emplearán condiciones suaves de reacción (37ºC, pH 7)
Validación in vitro de las sondas de folato:
A partir de la librería de sondas sintetizadas tanto de marcaje directo como indirecto (Act.4.1 y Act.4.2.), se seleccionarán aquellos 3 trazadores que presenten
mejores propiedades fisicoquímicas para la evaluación in vitro de su especificidad hacia macrófagos activados.Para ello, estas nuevas moléculas serán estudiadas por separado en presencia de macrófagos activados macrófagos no activados, y células A375 (control) carentes de receptores de folato. En dicho proceso experimental, los trazadores (2030 mCi) se incubarán a 37ºC en presencia de estos dos tipos de macrófagos y células control para llevar a cabo el estudio comparativo in vitro de la captación específica de los mismos. La actividad captada por las células será medida mediante contador gamma.
Validación in vivo de las sondas de folato:
Se llevarán a cabo estudios de imagen PET/CT tras la administración intravenosa de los nuevos trazadores (o 18FFDG como técnica de referencia) en tres modelos animales diferentes: 1) modelo de isquemiareperfusión en raton; 2) modelo de placa arteroesclerótica en conejo; y 3) en un modelo de endocarditis infecciosa en rata. Ver sección “Aspectos éticos relevantes” para conocer el tamaño muestral de los grupos.
Nanopartículas magnéticas para la detección de cáncer en páncreas por resonancia magnética
Este objetivo pretende desarrollar unos agentes de contraste basados en nanopartículas magnéticas funcionalizadas para la detección de tumores de páncreas. Estos sistemas serán evaluados en un modelo animal de carcinoma ductal de páncreas (PDAC)
Síntesis de nanopartículas magnéticas (NPM):
Se prepararán nanopartículas fundamentalmente de óxido de hierro por los métodos de descomposición térmica en medio orgánico y de coprecipitación en
agua. El primero ofrece partículas de tamaño controlable, con muy baja polidispersidad. El segundo proporciona nanopartículas con mayor distribución de tamaños pero es más fácilmente escalable (ya se usa a nivel industrial). Con el fin de mejorar las propiedades de interés para este proyecto , se usarán otros metales de transición (p. ej. Mn, Zn, Co) como dopantes para obtener ferritas subestequiométricas, MxFe3xO4 cuya capacidad para mejorar notablemente las propiedades como agentes de contraste está demostrada. Las NPM se recubrirán con moléculas (p. ej. DMSA, DOPA, APS) que proporcionen estabilidad electrostática y grupos funcionales libres (carboxilo, amino, alcohol) que permitan la posterior conjugación química de otras sustancias con actividad. Las partículas obtenidas serán caracterizadas por las técnicas habituales como XRD, TEM, DLS, VSM, etc. Los estudios de relaxometría para evaluar la capacidad de las NPM para actuar como agentes de contraste se llevarán a cabo en el TLCVIT.
Funcionalización de NPM:
Tras la síntesis las nanopartículas se modificarán con estabilizantes basados en polietilenglicol (PEG) y anticuerpos (Abs) seleccionados para el diagnóstico del PDAC (Páncreas: Tg.Ela1tTA ; TetoCre; KRas LSLG12Vgeo). Para poder hacer estas modificaciones derivados de PEG de distinto tamaño se modificarán con grupos bisfosfonatos (BFN), los cuales tienen una alta afinidad por las NPMs. La incubación de las NPM con los PEGBFN desplazará varios grupos de DMSA dando lugar a nanoparticulas modificadas con PEG. De una manera similar los anticuerpos seleccionados serán modificados por grupos BFN y utilizados en la funcionalización de las nanopartículas. La cantidad de anticuerpo en las nanopartículas será determinado por diversos métodos como el test de Bradford.
Evaluación in vitro de las NPM:
La capacidad de las nanopartículas de reconocer las células dianas se realizará en cultivos celulares mediante la incubación en células que expresen, o no, los receptores diana a distintas temperaturas (4 C o 37 C) y distintos tiempos (4 h y 16 h). Tras la incubación se lavarán las células y se cuantificará la presencia de las NPM mediante un test de Prusia y/o ICPMS. También se llevarán a cabo estudios de toxicidad y muerte celular (e.g. AlamarBlue, Anexina V).
Evaluación en modelos animales.
El modelo animal elegido es un ratón genéticamente modificado (GEMM) basado en la expresión condicional del oncogén KRas en las células acinares. El modelo de PDAC que se utilizará en nuestro laboratorio ofrece la ventaja adicional de activar el oncogén endógeno KRasG12V en el tejido pancreático adulto, recapitulando también en este aspecto al desarrollo tumoral en humanos desarrollo de tumores espontáneamente en su localización anatómica (ver sección Aspectos éticos relevantes). Es un sistema TetOff por lo que necesitamos bloquear la expresión del oncogén, así como la delección de genes supresores, para evitar que los ratones desarrollen cáncer de páncreas. El tratamiento bloqueador se realiza o bien con doxy en el agua de bebida, o con dieta suplementada con doxiciclina (comercial). Estos tratamientos se administran a los ratones desde el inicio del cruce hasta los dos meses de edad. En estas condiciones, los ratones no son capaces de desarrollar tumores de páncreas hasta que suprimimos la doxiciclina y tardarán entre 4 y 6 semanas en desarrollar los PDAC.
Nanopartículas magnéticas para la detección no invasiva mediante resonancia magnética de infiltrado de neutrófilos tras isqumia / reperfusión miocárdica.
Es conocido que el infiltrado de neutrófilos tras un insulto por isquemia/reperfusión (infarto agudo de miocardio) juega un papel fundamental tanto en la obstrucción microvascular como en el daño final infringido al corazón. Recientemente en un modelo de animal grande (cerdo) de isquemia/reperfusión miembros de este consorcio han caracterizado mediante histología la dinámica de infiltrado inflamatorio postinfarto (FernandezJiménez
et al. J Am Coll Cardiol 2015). La posibilidad de identificar el infiltrado inflamatorio de neutrófilos de manera no invasiva permitiría una mejor estratificación de riesgo de demodelado adverso postinfarto.
OBJETIVO PRINCIPAL: Diseño, síntesis y escalado de nanopartículas magnéticas funcionalizadas para la detección de neutrófilos en un modelo porcino de isquemia/reperfusión miocárdica mediante uso de resonancia magnética.
Síntesis de nanopartículas magnéticas (NPM):
Se prepararán nanopartículas de óxido de hierro fundamentalmente por el método de descomposición térmica. Este método ofrece partículas de tamaño
uniforme y controlable. La adición de otros metales de transición (e.g. Co, Zn, Mn) serán evaluados con el fin de mejorar las propiedades de agente de contraste. Una vez realizada la síntesis en medio orgánico los ligando se intercambiarán por DMSA y mediante diálisis se eliminará todo el resto de disolventes y reactivos utilizados en el proceso. La síntesis por coprecipitación se evaluará si las cantidades necesarias en los modelos animales grandes (cerdos) son altas. Este método proporciona nanopartículas con propiedades algo inferiores a las que se obtienen por descomposición térmica y con mayor distribución de tamaños, pero es más fácilmente escalable y siguen siendo útiles para biomedicina (de hecho, ya se usa a nivel industrial). En este caso al realizarse en medio acuoso, la purificación es más sencilla, mediante lavados y re dispersión de las nano partículas. Las partículas obtenidas serán caracterizadas por las técnicas habituales como XRD, TEM, DLS, VSM, etc.
Funcionalización de NPM:
Tras la síntesis las nanopartículas se modificarán con estabilizantes basados en polietilenglicol (PEG) y anticuerpos (Ab) específicos para neutrófilo porcino (el Anti6D10 de BioRad, anticuerpo ya testado por el grupo). Para poder hacer estas modificaciones derivados de PEG de distinto tamaño se modificarán con grupos bisfosfonatos (BFN), los cuales tienen una alta afinidad por las NPM. La incubación de las NPM con los PEGBFN desplazará varios grupos de DMSA dando lugar a nanoparticulas modificadas con PEG. De una manera similar el anticuerpo seleccionado será modificado por grupos BFN y utilizados en la funcionalización de las nanopartículas. La cantidad de anticuerpo en las nanopartículas será determinada por diversos métodos como el test de Bradford.
Evaluación in vitro de las NPM:
La capacidad de las nanopartículas de reconocer los neutrófilos porcinos se realizará en cultivos celulares mediante la incubación en células que expresen, o no, los receptores diana a distintas temperaturas (4 C o 37 C) y distintos tiempos (4 h y 16 h). Tras la incubación se lavarán las células y se cuantificará la presencia de las NPM mediante un test de Prusia y/o ICPMS. También se llevarán a cabo estudios de toxicidad y muerte celular (e.g. AlamarBlue, Anexina V).
Evaluación en modelos animales:
Se utilizará el modelo de isquemia/reperfusión desarrollado por el grupo de CNIC (ver publicaciones del grupo). En resumen, en cerdos de 35Kg de peso aproximadamente se realiza un abordaje arterial femoral percutáneo con técnica de Seldinger y se lleva un catéter guía hasta el origen de la coronaria izquierda. Se progresa guía de angioplastia distal en la arteria coronaria descendente anterior (DA) y a través de ella se lleva un balón de angioplastia que se hincha a nivel de la DA media durante 45 minutos. Posteriormente se deshincha en balón y se permite la reperfusión coronaria. 90 minutos después
de la reperfusión se inyectan las NP dirigidas hacia neutrófilos por vía sistémica venosa y el animal es llevado a la resonancia magnética de 3T dedicada para estudios porcinos. Se realiza estudio anatómico, funcional, así como secuencias paramétricas para cuantificación de hierro (mapas de T2*, T1´, T1 y T2). Los animales son sacrificados tras la resonancia magnética para realizar estudios de histología para colocalización de NPM con neutrófilos y correlación con resultados de imagen. Otro grupo de animales será sometido a resonancia magnética 24 horas después de la reperfusión. Estos animales serán despertados tras la reperfusión y a las 24h reanestesiados e inyectados con las NP dirigidas contra los neutrófilos y resonancia posterior. Se estudian ambos tiempos porque el infiltrado de neutrófilos sigue un patrón espacial diferente (intravascular en aras de obstrucción microvascular en la reperfusión inmediata, y a las 24h dentro del tejido miocárdico).